食用菌滅菌器操作事項首先將鍋內滅菌筐取出，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。  
2．放回滅菌筐，關閉鍋門。  
3．向鍋內通入蒸汽，并同時打開排氣閥，以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。
4．滅菌所需時間到達后，打開排氣閥，讓滅菌鍋內溫度自然下降，打開蓋子，取出滅菌物品。 
5．將取出的滅菌培養基放入 37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。