用-150~-196℃的液氮超低溫保藏菌種，是現在菌種保藏中使用的一項先進技術。目前， 美國標準菌種保藏委員會(American Type Cultur Collection，ATCC) 保存的17萬余株微生物菌種， 全部采用冷凍干燥和液氮超低溫法保藏。超低溫能使菌種的代謝水平降到最低，菌種基本上不發生變異。試驗證明，用這種方法能保存所有的食用菌菌種，包括一些不能用冷凍干燥法保藏的菌種。美國標準菌種保藏委員會曾用液氮法保藏了粗柄羊肚菌、大禿馬勃、墨汁鬼傘等培養 真菌，連續觀察了9年，發現這些菌種仍能保持良好的活力。也有人將蘑菇菌種在-160~-196℃下保藏22~26個月后，發現這些菌種仍完好無損。最有趣的V定 是怕冷的草菇在10%甘油保護下，居然也能在超低溫冰箱中保藏。
       雖然液氮保藏法有保藏的菌種不宜郵寄交流，還需要特殊的設備———液氮罐等缺點，但其保藏效果好、范圍廣、操作簡單，因此得到普遍應用，其方法如下：
       (1)將保藏用的瓊脂培養基(馬鈴薯煮汁1000mL、葡萄糖20g、酵母膏1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g)倒人無菌培養皿內制成平或少 板，然后在平板中心接種食用菌菌絲，在適溫下培養至菌絲發滿平板。
       (2) 保藏安部瓶的口徑約10mm， 大小為7.5mmx10mm， 內盛經滅菌的冰滿 凍保護劑0.8mL。冰凍保護劑常用10%甘油或10%二甲亞砜(DMSO) ， 需經高壓滅菌后使用。
       (3)取直徑5mm的打孔器在菌落的外圍切割瓊脂塊，用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入滅菌的保藏安瓿瓶內的保護劑中。注意在保藏菌種管上作永久標記。也可直接用無菌保護劑制備菌懸液。
       (4)用火熔封安部瓶的瓶口。
       (5)將封好口的安部瓶放在慢速冷凍器內，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降藏 溫，直至-35℃左右，使瓶內的保護劑和菌絲塊凍結。然后凍結速度不再控制，至到-150℃以下。將凍結的安部瓶立即置于液氮罐中保藏。液氮罐內氣相溫度為-150℃，液相溫度為-196℃。
       (6)復蘇培養。啟用液氮超低溫保存的菌種時，應先將安瓿瓶置于35~40℃的溫水中來回振蕩，使瓶內的冰塊迅速融化，然后在無菌條件下開啟安瓿瓶，取懸浮的菌絲塊移植于適宜的培養基上活化培養。
使用液氮超低溫法保藏菌種時，操作者要戴皮手套或棉手套，嚴防液氮飛濺傷人；取菌種時，要垂直輕取蓋塞，再垂直提起提筒，輕輕移到容器中取物。取畢立即將提筒與蓋塞復位，以防空氣中氮氣過濃引起窒息。