【作者】王芬 朱平

【機構】北京協和醫學院中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室衛生部天然藥物生物合成重點實驗室

【摘要】7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2是克隆自真菌香菇的兩個雙功能酶(序列一致性97%),具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶雙重活性,能特異性地水解移除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等紫杉烷上的木糖基。采用生物信息學方法對兩個酶蛋白進行酶活性中心預測,初步確定Asp300和Glu529分別為親核試劑和一般酸/堿催化劑,而Asn172-Gly173-Arg174和Lys207-His208為底物結合結構域。以LXYL-P1-2為研究對象,以畢赤酵母細胞為表達宿主,應用定點突變技術獲得了N172A、G173A、R174A、K207A、H208A、D300N和E529Q突變體,并進行了酶活性分析。結果顯示:在分別以PNP-Xyl、PNP-Glc和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇為底物時,N172A、G173A、R174A、K207A、D300N和E529Q的β-木糖苷酶與β-葡萄糖苷酶活性大幅度下降甚至完全消失;H208A的β-木糖苷酶活性也顯著下降,但仍保持98%的β-葡萄糖苷酶活性。其結果初步驗證了對上述兩個酶蛋白的活性中心的預測,為進一步揭示7-木糖紫杉烷糖基水解酶結構與功能的關系提供了實驗依據。 

【基金】國家自然科學基金(No.30770229； No.31270796)；

【關鍵詞】香菇; β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶; 酶活性中心預測; 定點突變; 酶活性分析;